Менше стресу – вищий урожай: запатентований біостимулятор на основі гліцинбетаїну та рослинних білків

Абіотичні стреси, зокрема посуха, засолення, екстремальні температури та дефіцит елементів живлення, значно обмежують продуктивність культур і становлять загрозу продовольчій безпеці у світі. Добре відомо, що позакореневе внесення елементів живлення, із біостимуляторами (наприклад, екстрактом водоростей) або без них, може допомогти зменшити негативний вплив таких стресів, включаючи дефіцит елементів живлення.

Щоб також зменшити вплив кліматичних чинників, біостимулятори стали перспективним інструментом у стійкому сільському господарстві – вони підвищують стійкість рослин до стресу та покращують їхній ріст і розвиток. Серед таких речовин особливу увагу приділено гліцинбетаїну (ГБ) і гідролізату протеїнів (ГП) через їхню ефективність у зменшенні впливу абіотичних стресів. 

У цьому дослідженні оцінюється агрономічна ефективність нової формуляції РБ, що поєднує гліцинбетаїн і рослинний гідролізат протеїнів. Попередні випробування виявили виражену синергію між цими двома речовинами. Цей винахід уже отримав патентний захист у кількох країнах, а комерційний продукт під торговою назвою Betino^®, доступний для виробників, зокрема, в органічному землеробстві.

Гліцинбетаїн і пом’якшення абіотичного стресу

Гліцинбетаїн (ГБ) є добре відомим осмопротектором, який накопичується в рослинах в умовах стресу, стабілізуючи клітинні структури та підтримуючи осмотичний баланс. Його захисну дію широко задокументовано у відповідь на посуху, засоленість і екстремальні температури. ГБ посилює ферментативну активність, захищає фотосинтетичний апарат і покращує здатність рослин утримувати воду. Екзогенне застосування ГБ продемонструвало обнадійливі результати на різних культурах, підвищуючи стійкість до стресу та покращуючи врожайність в несприятливих умовах навколишнього середовища. 

Гідролізат протеїнів та його роль у пом'якшенні абіотичного стресу

Гідролізат протеїнів (ГП), отримують як з тваринних, так і з рослинних джерел, багатий на біоактивні пептиди, амінокислоти та сигнальні молекули, які покращують метаболізм рослин і стійкість до стресу. Ці біоактивні сполуки покращують засвоєння елементів живлення, модулюють активність антиоксидантних ферментів і регулюють гормональний баланс в умовах стресу. Зокрема, повідомляється, що гідролізати рослинного походження підвищують регуляцію генів, пов'язаних з реакціями на стрес, що призводить до підвищення стійкості до посухи та засоленості. З іншого боку, гідролізати тваринного походження є багатим джерелом пептидів із властивостями стимулювання росту, впливаючи на архітектуру коренів і засвоєння елементів живлення. Ефективність гідролізату протеїнів варіюється залежно від його складу, походження та способу застосування, що свідчить про потенційні переваги при використанні в поєднанні з іншими біостимуляторами. Ефективність ГП як біостимуляторів може змінюватися залежно від їхнього джерела – рослинного чи тваринного походження – а також від конкретної культури та умов навколишнього середовища. Деякі дослідження показали, що гідролізати рослинного походження можуть мати більші переваги в певних контекстах.

Ферментативний гідроліз зазвичай є кращим за хімічний гідроліз для виробництва гідролізату рослинних протеїнів через кілька переваг:

1. Збереження L-амінокислот: хімічний гідроліз може призвести до утворення D-амінокислот, які є менш біодоступними для рослин. Навпаки, ферментативний гідроліз зберігає амінокислоти в їхній природній L-конфігурації, підвищуючи їхню ефективність як біостимуляторів.   

2. М'які умови обробки: ферментативний гідроліз відбувається в м'якших умовах (наприклад, нейтральний pH і помірні температури), мінімізуючи деградацію чутливих амінокислот і запобігаючи утворенню небажаних побічних продуктів. 

3. Підвищена біоактивність: контрольований характер ферментативного гідролізу дозволяє виробляти специфічні біоактивні пептиди, які можуть покращити ріст рослин і стійкість до стресу.   

Таким чином, використання ферментативного гідролізу для виробництва гідролізату рослинних протеїнів забезпечує вищу якість продукту з більшою біостимулюючою активністю, насамперед завдяки збереженню корисних L-амінокислот і утворенню біоактивних пептидів. Важливо зазначити, що на ефективність ГП можуть впливати такі фактори, як метод гідролізу, специфічний склад гідролізату та цільовий вид рослин. Тому, хоча деякі дані вказують на вищу ефективність ГП рослинного походження в певних сценаріях, оптимальний вибір між ГП рослинного та тваринного походження може залежати від конкретного сільськогосподарського застосування та умов. 

Останні наукові публікації підтверджують гіпотезу про те, що комбінування різних біостимуляторів може призвести до адитивних або синергічних ефектів, підвищуючи загальну ефективність у пом'якшенні стресу. Застосування комбінованих біостимулюючих продуктів з різних природних екстрактів залишається недостатньо дослідженою стратегією. Вивчення впливу та механізмів реакції численних сумішей може підвищити практичні переваги РБ. Ймовірно, ці дослідження стануть ключовим напрямом для майбутніх наукових робіт пов'язаних з РБ у майбутньому. Розуміння взаємодії між цими біостимуляторами має важливе значення для оптимізації їх застосування в сталому сільському господарстві. Гліцинбетаїн і гідролізат протеїнів впливають на різні, але взаємодоповнюючі шляхи реакції на стрес, що робить їх комбінацію перспективним підходом для підвищення стійкості рослин. У той час як гліцинбетаїн насамперед діє як осмопротектор, стабілізуючи клітинні структури та підтримуючи водний потенціал, гідролізат протеїнів забезпечує біоактивні сполуки, які модулюють метаболічні та фізіологічні процеси в умовах стресу.

Це дослідження має на меті оцінити агрономічні ефекти нової біостимулюючої формуляції, що поєднує гліцинбетаїн і ферментативний гідролізат протеїнів рослинного походження, на пом'якшення абіотичного стресу на кукурудзі та полуниці. Проведене в кліматичних камерах, це дослідження надає цінну інформацію про ефективність комбінацій біостимуляторів у покращенні продуктивності сільськогосподарських культур. Результати сприятимуть зростанню кількості доказів, що підтверджують інтегровані стратегії біостимуляції та їхню роль у сталому управлінні сільськогосподарськими культурами. РБ було протестовано на молодих рослинах кукурудзи в умовах посухи. Крім того, РБ було протестовано на полуниці в умовах заморозку, який є глобальним абіотичним стресом для плодоовочевих культур. Серія попередніх випробувань, проведених як у контрольованих умовах, так і у відкритому ґрунті, мала на меті визначити найефективнішу комбінацію гліцинбетаїну та гідролізату рослинних протеїнів. Однією з ключових переваг досліджуваної формуляції є її висока стабільність і відтворюваність складу, який залишається стабільним з мінімальними відхиленнями порівняно зі звичайними формуляціями, такими як рослинні екстракти або чисті продукти з водоростей. Як наслідок, ефективність продукту менше залежить від самої формуляції, а більше від умов застосування.

Вплив формуляції РБ на основі гліцинбетаїну (ГБ) і рослинного гідролізату протеїнів (РГП) (ГБ-РГП) на ранній ріст рослин кукурудзи після дворазової обробки: у фази BBCH 13 і BBCH 14 за 4 дні до та через 2 дні після індукованого посухового стресу.

Модельований дослід зі стресом від посухи проводили в кліматичній камері (walk-in growth chamber) за контрольованих умов в Інституті Fresenius* з метою оцінки ефективності біостимулятора ГБ-PГП при позакореневому застосуванні для пом’якшення впливу стресу. У досліді з повною рандомізацією блоків (RCBD - Randomized Complete Block Design) використовувалася кукурудза (Zea mays, гібрид DKC3730), вирощена з насіння та пересаджена окремо в горщики у вологий піщаний ґрунт. Вміст вологи в ґрунті було відрегульовано до 70 % від максимальної вологоємності (WHC – water holding capacity) ґрунту у всіх варіантах. 70 % WHC підтримувалася протягом усього періоду випробування у всіх варіантах до фази BBCH 15. Після цієї фази WHC було відрегульовано до 50 % у варіантах для індукування посухового стресу. Було закладено 4 повторності для кожного з наступних варіантів:

1. Контроль без обробки та без посухи (UTC);
2. Контроль без обробки з індукованим посуховим стресом;
3. Біостимулятор ГБ-РГП з індукованим посуховим стресом. Біостимулятор застосовувався позакоренево в стандартній нормі 1 л/га (із розрахунку 200 л води/га) на рослини в умовах посухового стресу в такі терміни: за 4 дні до початку посухового стресу і повторно через 2 дні після початку посухового стресу. 

Дослідження впливу формуляції біостимулятора на основі гліцинбетаїну (ГБ) та гідролізату протеїнів рослинного походження (PГП) – ГБ-PГП на морозостійкість суниці садової на початку цвітіння після позакореневого обприскування у фазі BBCH 62/63 (початок цвітіння), за 24 години до моделювання стресу від заморозків (2020 рік). Модельований дослід зі стресом від заморозків проводили в кліматичній камері (walk-in growth chamber) за контрольованих умов в Інституту Fresenius* з метою оцінки ефективності біостимулятора (ГБ-PГП) при позакореневому застосуванні для зниження наслідків абіотичного стресу. У досліді з повною рандомізацією блоків (RCBD — Randomized Complete Block Design) використовували суницю садову сорту Clery (рослини фріго), які висаджували як окремі рослини в горщики з вологим піщаним ґрунтом.

Умови досліду були поділені на 4 фази:

Кліматичні умови до BBCH 63 (26.05.2020-14.06.2020): денна/нічна температура 21/12 °C, відносна вологість 40–60%, фотоперіод 14 годин.

Адаптаційна фаза (15–16.06.2020): усі рослини утримували протягом 48 годин при +10 °C вдень і +5 °C вночі, фотоперіод 14 годин.

Фаза стресу від заморозків (17–19.06.2020): рослини варіантів 2-3 піддавали впливу температури –3 °C протягом 3 годин, після чого утримували при +10 °C вдень і +5 °C вночі, фотоперіод 14 годин.

Фаза відновлення після стресу (20.06.2020–21.07.2020): всі варіанти утримували в однакових умовах: температура день/ніч: 21/12 °C, відносна вологість: 40–60%, фотоперіод: 16 годин.

Полив: приблизно 40 мл води на одну рослину/горщик щодня. Біостимулятор наносили позакоренево в стандартній нормі 2 л/га (400 л води/га) за 24 години до моделювання стресу від заморозків. Стрес викликали 16.06.2020, підтримуючи температуру –3 °C протягом 3 годин.

Отримані дані оцінювання аналізували методом дисперсійного аналізу (ANOVA) як для первинних, так і для оброблених даних.

Результати

Дослід №1: посуховий стрес у молодих рослин кукурудзи 

Вплив обробки РБ на сиру масу рослин кукурудзи під час посухового стресу порівняно з контролем без і з посуховим стресом (рисунок 1).

Посуховий стрес значно зменшив сиру масу молодих рослин кукурудзи. Після обробки РБ сира маса досягла значення, подібного до необробленого контролю без посухового стресу. 

Вплив обробки РБ на вміст хлорофілу (виражений в умовних одиницях) рослин кукурудзи в умовах посухового стресу порівняно з контролем без посухового стресу та з посуховим стресом (рисунок 2).

Під час першого обліку, безпосередньо перед другою обробкою, статистично достовірних відмінностей не зафіксовано. На момент другого обліку всі оброблені варіанти мали вищі значення вмісту хлорофілу. Під час третього обліку, через 21 день після останньої обробки, спостерігалося зниження вмісту хлорофілу, за винятком варіанта з PБ. Вміст хлорофілу достовірно відрізнявся між варіантами. Середні значення, позначені однаковими літерами, не відрізняються статистично (P = 0,05, тест Ст’юдента-Ньюмана-Кейлза).

Дослід №2. Посуховий стрес у молодих рослин кукурудзи 

Вплив обробки біостимулятором PБ на сиру масу рослин кукурудзи за умов посухового стресу порівняно з контролем без стресу та з посуховим стресом (рисунок 3).

Посуховий стрес достовірно зменшив сиру масу рослин кукурудзи. Після обробки біостимулятором PБ сира маса досягла значення, подібного до контрольного варіанта без посухового стресу.

Вплив обробки біостимулятором PБ на вміст хлорофілу (виражений в умовних одиницях) у рослинах кукурудзи за умов водного стресу порівняно з контролем без і з посуховим стресом (рисунок 4).

Проводилися обліки вмісту хлорофілу. Вимірювання здійснювали безпосередньо перед другою обробкою (6 днів після першої обробки – 6 DA-A), а також через 14 і 21 день після обробки. Застосування препаратів здійснювали за 4 дні до та 2 дні після індукції посухового стресу.

У всі строки обліку вміст хлорофілу був вищим у всіх оброблених рослинах порівняно з необробленими рослинами, що перебували під посуховим стресом.

На дату другого обліку (18.11.2020) рослини у варіанті з біостимулятором PБ мали вищий вміст хлорофілу, ніж під час першого обліку (04.11.2020).

На момент останнього обліку, через 21 день після останньої обробки, вміст хлорофілу знизився в усіх варіантах.

Дослід №3. Посуховий стрес у молодих рослин кукурудзи 

Вплив обробки біостимулятором PБ на сиру масу (г) рослин кукурудзи за умов посухового стресу порівняно з контролем без стресу та з посуховим стресом (рисунок 5).

У цьому досліді найвищу сиру масу зафіксовано у варіанті з обробкою біостимулятором PБ, навіть у порівнянні з контролем без водного стресу.

Вплив обробки біостимулятором PБ на вміст хлорофілу (виражений в умовних одиницях) у рослинах кукурудзи за умов посухового стресу порівняно з контролем без і з посуховим стресом (рисунок 6).

У всі строки обліку вміст хлорофілу був вищим у рослин кукурудзи, оброблених біостимулятором PБ, порівняно з необробленими рослинами, що перебували під дією посухового стресу.

Дослід №4. Стрес від заморозків у суниці

Визначення впливу біостимулятора PБ на пошкодження плодів суниці заморозками при обприскуванні за 24 години до індукції стресу у фазі BBCH 63. Німеччина, 2020 рік (рисунок 7)

Пошкодження плодів суниці зменшилося з майже 69 % до приблизно 40 % після одноразової обробки біостимулятором PБ (контроль без заморозкового стресу = 0 %).

Визначення впливу біостимулятора PБ на товарну врожайність суниці за обприскування за 24 години до індукції стресу від заморозку у фазі BBCH 63. Німеччина, 2020 рік (рисунок 8).

Зафіксоване зниження рівня пошкодження плодів спричинило збільшення маси товарної продукції після обробки біостимулятором PБ, що підкреслює його високу ефективність у пом’якшенні негативного впливу заморозків на чутливі до холоду культури, зокрема суницю.

Результати досліджень, проведених в контрольованих умовах у кліматичних камерах, свідчать про те, що новостворений біостимулятор на основі гідролізату протеїнів рослинного походження та гліцинбетаїну покращує стійкість сільськогосподарських культур до абіотичних стресів, зокрема до посухи та заморозків.

Випробування нових біостимуляторів (PБ) в умовах контрольованого середовища, таких як кліматичні камери, має кілька переваг порівняно з польовими дослідами, особливо за оцінювання реакцій рослин на абіотичні стреси. Контрольоване середовище дозволяє дослідникам точно регулювати такі змінні, як температура, вологість і доступність елементів живлення, що забезпечує сталі та відтворювані умови стресу. Така точність сприяє достовірній оцінці ефективності біостимулятора за певного чинника стресу.

Натомість у польових умовах спостерігається значна мінливість довкілля, що ускладнює прогнозування та моніторинг виникнення й інтенсивності абіотичних стресів. Часто такі стреси накладаються один на одного. До того ж, непередбачувані погодні умови та неоднорідність ґрунтів можуть спричиняти варіабельність даних, що ускладнює їх інтерпретацію. Проте польові дослідження є критично важливими для оцінки того, як біостимулятор працює в реальних умовах, де одночасно можуть діяти кілька факторів стресу. Такі досліди дають уявлення про практичну доцільність та ефективність застосування біостимуляторів у різноманітних екологічних умовах.

Отже, комплексна стратегія оцінювання зазвичай передбачає початкове тестування в контрольованих умовах для з’ясування механізмів дії та ефективності, а потім – проведення польових досліджень з метою вивчення їх ефективності в природному середовищі. Такий комбінований підхід забезпечує впевненість у тому, що біостимулятор буде не лише ефективним за певного виду стресу, але й практичним для використання у сільському господарстві.

Отримані результати, здобуті в чітко контрольованих умовах, показали, що в усіх проведених дослідах PБ підвищував стійкість культур до абіотичних стресів. Це є найкращою передумовою для подальшого впровадження PБ у польових умовах, з адаптацією норми витрати та частоти застосування залежно від інтенсивності та тривалості дії стресових факторів навколишнього середовища.

Досліджуваний PБ можна вважати «біостимулятором нового покоління», який реалізує синергічну біостимулюючу дію двох різних органічних немікробних компонентів: спеціально сформульованого рослинного гідролізату протеїнів та гліцинбетаїну в ретельно підібраному співвідношенні.

1-й компонент: ферментативно гідролізовані протеїни рослинного походження

Фракція гідролізованих протеїнів є результатом досліджень численних видів рослин і їх характерного білкового складу. Крім того, шляхом варіювання співвідношення компонентів і використання м’якого ферментативного (а не агресивного хімічного) гідролізу був отриманий гідролізат протеїнів, особливо збагачений чотирма амінокислотами, що відіграють важливу фізіологічну роль у стійкості рослин до стресу: глутамат, пролін, аспарагінова кислота і лейцин. Насправді, понад 50% гідролізату рослинних протеїнів складається саме з цих окремих амінокислот. Однією з важливих функціональних ролей цих амінокислот, а також інших, присутніх у гідролізаті, є їхня дія як сигнальних молекул під час стресових подій.

Сигнальні молекули відомі як регулятори метаболізму, росту і розвитку рослин, а також відповіді на чинники довкілля. До біомолекул, які беруть участь у передачі сигналів при абіотичних стресах, належать окремі амінокислоти, пептиди, саліцилова кислота та інші фітогормони. Протягом багатьох років уявлення про міжклітинну сигналізацію в рослинах ґрунтувалося на п’яти класичних фітогормонах — ауксин, цитокінін, етилен, гіберелін і абсцизова кислота. Проте біохімічні та генетичні дослідження ідентифікували специфічні рослинні амінокислоти та пептиди, які відіграють критичну роль у рості й розвитку рослин в умовах абіотичного стресу. Додаткові ефекти гідролізату рослинних протеїнів: стимуляція поглинання елементів живлення через коріння, що проявляється у підвищеному вмісті елементів у насінні кукурудзи. Вплив на мікробіом філосфери після позакореневого внесення, що призводить до змін у фізіологічних процесах і підвищує стійкість до стресових умов довкілля.

2-й компонент: Гліцинбетаїн (ГБ)

Адаптація рослини до абіотичних стресів включає накопичення в цитоплазмі певних органічних сполук з низькою молекулярною масою, відомих як сумісні осмоліти. Дані численних експериментів свідчать про те, що гліцинбетаїн відіграє важливу роль як осмоліт в умовах різноманітних абіотичних стресів, таких як посуха, спека, засолення та низькі температури. Вважається, що ГБ взаємодіє з макромолекулами, такими як білки та мембранні комплекси, стабілізуючи їх структуру та активність, захищаючи від ушкоджень, спричинених стресовими чинниками. Здатність синтезувати гліцинбетаїн варіює між видами рослин. Такі культури, як томати, бавовник, соя, кукурудза, шпинат і ячмінь, накопичують високі рівні ГБ у хлоропластах, тоді як інші, наприклад, тютюн або рис, майже не здатні його синтезувати. Отже, очікується, що позакореневе застосування ГБ може мати ще більший ефект у культурах з низькою власною здатністю синтезу цього осмоліту під час стресу. Додаткові важливі ролі гліцинбетаїну: посилення антиоксидантного потенціалу клітини, знешкодження активних форм кисню (АФК), регуляція експресії генів, які кодують антиоксидантні ферменти (зокрема супероксиддисмутази, пероксидази та каталази), захист фотосинтетичних пігментів.

Елвін Александер (Alvin Alexander)
Зьорен фон Нолтінг (Sören von Nolting)
Відділ досліджень і розвитку Uniferx International GmbH,
Остзебад-Нінгаген, Німеччина (Uniferx International GmbH;
Research & Development Dept., Ostseebad Nienhagen, Germany)