Біотехнологія в рослинництві — поліпшення технологій у селекції рослин

Сучасна біотехнологія рослин - сума технологій, які розвинені із молекулярної та клітинної біології рослин, - нова стадія в розвитку технології селекції рослин.

За допомогою цих технологій поліпшення ознак може відбуватися на рівні індивідуального гена, а окремі гени, що визначають певну ознаку, можуть бути ідентифіковані. За ними може бути проведений відбір, їх можна ізолювати, ввести, вилучити або модифікувати в генотипі рослини чи в сорті. Внесок біотехнології у сільськогосподарське виробництво полягає в полегшенні традиційних методів селекції рослин, розробці нових технологій, що дають змогу підвищити ефективність сільського господарства. Методами генетичної та клітинної інженерії створено високопродуктивні та стійкі проти шкідників, хвороб, гербіцидів сорти сільськогосподарських рослин. Розроблено техніку оздоровлення рослин від накопичення інфекцій, що особливо важливо для культур, які розмножуються вегетативно (картопля та ін.). Однією із актуальних проблем є можливість керувати процесом азотфіксації, у тому числі можливість введення генів азотфіксації в геном корисних рослин, а також керування процесами фотосинтезу. Ведуться дослідження з поліпшення амінокислотного складу рослинних білків, розробляються нові регулятори росту рослин, мікробіологічні засоби захисту рослин від шкідників та хвороб, бактеріальні добрива.
На сучасному етапі розвитку селекції для його інтенсифікації ефективне використання таких біотехнологічних методів, як культура ізольованих тканин, клітин та органів рослин, клітинна селекція й генетична інженерія, які дають можливість за порівняно короткі строки створити і розмножити цінний вихідний високопродуктивний матеріал, гетерозисні гібриди та сорти сільськогосподарських рослин. Розробка основ методу культури тканин рослинних організмів має порівняно коротку історію й починається з досліджень, виконаних Габерландтом у 1902 р. Проте кожне відкриття, зроблене в цій галузі, знайшло використання в прикладних дослідженнях.
 Усі проблеми, які розробляють у культурі in vitro, можна поділити на три основні групи:
n збереження генетичної інформації клітин (мікроклональне розмноження рослин та депонування, культура зародків, пиляків і насіннєвих зачатків);
n зміна генетичної інформації способом мутагенезу під впливом фізичних та хімічних чинників (культура калусів, клітинних суспензій, ізольованих протопластів);
n перенесення та відновлення генетичної інформації (генно-інженерне конструювання рослин з новими ознаками, соматична гібридизація).
Одним із найпоширеніших напрямів методу культури тканин є мікроклональне розмноження, за якого отримують генетично ідентичні форми, що сприяє збереженню генетично однорідного посадкового матеріалу. Як експлантат можна використовувати пазушні бруньки, молоді листки, деякі елементи квітів та суцвіть. Проте такий вид розмноження потребує конкретизації методу для кожної сільськогосподарської культури в зв'язку з особливостями її генотипу. Технологія мікроклонального розмноження будь-якої культури об'єднує чотири основні етапи: введення вихідної форми в стерильну культуру, власне мікророзмноження, укорінення розмножених пагонів, переведення стерильної культури в умови відкритого грунту. Розробка засобів вегетативного розмноження елітних рослин, гетерозисних гібридів та сортів in vitro дає змогу розв'язати проблему швидкого розмноження форм, що мають практичну цінність, а також збереження матеріалу для використання їх у рекурентній селекції.
Мікроклональне розмноження має певні переваги порівняно з традиційними методами розмноження: вирощування в штучних умовах (що контролюються) із меристематичних тканин дає можливість досягти вилучення вірусів та інших патогенних мікроорганізмів і одержати здоровий садивний матеріал; ріст рослин можна підтримувати протягом багатьох років; методом культури можна розмножувати форми, що не розмножуються вегетативно або не дають життєздатного насіння; можна вибирати генотипи, стійкі до несприятливих умов вирощування: екстремальні температури, посуха, засолення та закислення субстрату, пригнічувальна дія гербіцидів тощо, а також відбір продуктивніших форм в умовах in vitro; швидкість та коефіцієнт розмноження досягає 1:1000000 і дає можливість удвічі-втричі скоротити строки відбору та отримання нових рослин у селекційних дослідженнях.
На сучасному етапі існує кілька різних детально розроблених методів мікроклонального розмноження. Різняться вони станом вихідних клітин та тканин, які беруть для отримання мікроклонів. Найважливішою вимогою технології є гарантування повної стерильності та оптимальних умов для клітинного поділу й диференціації вихідної тканини. Потім слід домогтися утворення великої кількості мікроклонів та забезпечити їхнє вкорінення. Щоб ефективність мікроклонального розмноження була високою, потрібно на всіх етапах підтримувати оптимальні умови вирощування. Для цього для кожної культури розробляють конкретну методику мікроклонального розмноження.
Укорінені рослини в разі потреби розміщують на депонування понижених температур. Це дуже важливий процес, бо він дає змогу затримувати розвиток рослин і таким чином тривалий час зберігати їх без пересаджування, використовуючи за потреби. Для перенесення стерильних рослин у грунт треба відбирати серед них здорові, зі світлою, добре розвиненою кореневою системою.
У репродукованій культурі тканин видимих морфологічних відхилень немає. Генетична стабільність ізольованої культури спостерігається навіть після багатократних пасажів, що відкриває нові можливості в збереженні генофонду сільськогосподарських рослин. Збереження та подальше вегетативне розмноження рослин у культурі in vitro набуває великого значення в зв'язку з рекурентним відбором, оскільки без нього неможливе створення гібридів на ЧС-основі (чоловічостерильній основі). Із вирощених із допомогою культури in vitro маточних рослин та коренеплодів отримують високоякісне насіння.
У селекційній практиці водночас із мікроклональним розмноженням рослин широко використовують метод калусних культур із експлантів різних органів, які є додатковим резервом розмноження селекційного матеріалу. Він дає можливість практично використовувати в селекційному процесі новий тип мінливості - сомаклональну мінливість. Калусні культури багатьох сільськогосподарських рослин характеризуються великою нестабільністю.
Генетична варіабельність соматичних клітин є однією із причин неоднорідності рослин, одержаних із калусних тканин. Калусогенез - це перший етап на шляху отримання сомаклональних варіантів, що потребує перепрограмування способів розвитку клітини. Клітина, переведена в умови культивування in vitro, зберігає свою основну генетичну інформацію про цілий організм і за наявності відповідних умов може реалізувати її. Проте фізичні та хімічні фактори культивування, що мають мутагенну дію, а також генетична гетерогенність соматичних клітин експлантату створюють передумови для одержання генетично змінених рослин. Метод отримання сомаклональної мінливості дає можливість індукувати не тільки мінливість геному, а й плазмону. В основі феномену сомаклональної мінливості лежать складні процеси структурної і функціональної перебудови генетичного апарату клітин. Використовуючи його, вже отримано форми багатьох сільськогосподарських культур із цінними ознаками.
Однією з важливих проблем у селекційно-генетичних дослідженнях перехреснозапильних рослин є використання гетерозису. Основний і найбільш ефективний метод одержання стабільних ліній є експериментальна гаплоїдія. Унеможливлюючи багаторазове самозапилення рослин, вона дає змогу отримувати гомозиготний матеріал із збагачених у генетичному відношенні гібридів. Для одержання гаплоїдних рослин використовують культуру пиляків, зав'язі та насіннєвих зачатків. Індукція гаплоїдів залежить від генетичних властивостей рослин-донорів, фази розвитку насінників, розміщення квітконосів на рослині та низки інших чинників. Збільшення кількості гаплоїдів спостерігається в разі вилучення незапліднених насіннєвих зачатків з розкритих квіток, а також у разі запилення опроміненим пилком донорських рослин. Гаплоїди виявлено у багатьох сільськогосподарських культур. Спосіб отримання їх у культурі in vitro дає можливість використовувати явище гаплоїдії не тільки в генетичних дослідженнях, а й у практичній селекції.
Гетерогенність клітинної популяції суспензійних культур дає можливість одержати значну варіабельність ознак у рослин-регенерантів і відкриває широкі можливості для генетичних та селекційних досліджень. Хімічні компоненти поживного середовища й фізичні умови можуть виступати і як мутагенні, екстремальні фактори, що спричинюють зміни в нуклеїновому та білковому обмінах, структурі, формі й функціях клітини. В даному разі клітинна популяція в умовах культури in vitro характеризується фізіологічною, цитологічною і генетичною гетерогенністю. З'являються мутанти із зміненим морфогенезом, які можна взяти за основу в селекційно-генетичних дослідженнях. За клітинної селекції відбір клітинних ліній і рослин з новими успадкованими ознаками здійснюють на рівні клітин, що культивуються in vitro. Способи культивування рослинних клітин і регенерація з них рослин розроблені для багатьох важливих сільськогосподарських рослин. Перелік мутантів з важливими сільськогосподарськими ознаками, селекцію яких здійснюють на клітинному рівні, дуже великий. До них належать мутанти, стійкі до стресових чинників, гербіцидів, різних захворювань, засолення та закислення субстрату.
У зв'язку з тим, що можливості удосконалення рослин за допомогою рекомбінації практично невичерпні, головним завданням є пошук методів управління цим процесом і ефективного вибору найцінніших генотипів з бажаним комплексом ознак і властивостей.
Це стало можливим завдяки розробці методів клітинної і генетичної інженерії - культури протопластів і соматичної гібридизації та введення генетичного матеріалу в рослинні клітини і протопласти за допомогою трансформованої ДНК. Першим етапом у цьому напрямку досліджень є розробка методу отримання й культивування життєздатних протопластів. Одержання життєздатних протопластів зумовлене багатьма факторами, а саме: склад і концентрація ферментів, вибір осмотичного розчину, рН-середовища, фізіологічний стан тканини, умови передінкубаційного культивування. Виділені протопласти в подальшому використовують для отримання соматичних гібридів та соматичних цибридів, пересаджування органел, уведення чужорідної інформації.
Злиття протопластів та соматична гібридизація дають змогу:
n схрещувати філогенетично віддалені види рослин, які неможливо схрестити звичайним статевим способом;
n отримувати асиметричні гібриди, які несуть весь генний набір одного із батьків водночас з кількома хромосомами (або кількома генами чи тільки органелами і цитоплазмою) другого;
n створювати систему гібридизації, яка унеможливлює одночасно злиття трьох і більше батьківських клітин; одержувати рослини, гетерозиготні за неядерними генами;
n долати обмеження, які накладаються генеративними системами несумісності;
n схрещувати форми, які неможливо гібридизувати статевим способом через аномалії в морфогенезі або гаметогенезі батьків;
n гібридизувати клітини, які несуть різні епігенетичні програми. Використовуючи метод соматичної гібридизації ізольованих протопластів, селекціонери виводять гібриди від фізіологічно несумісних видів сільськогосподарських культур.
Головними чинниками, які підвищують продуктивність сільського господарства, є удосконалення способів вирощування рослин, створення продуктивніших сортів, поліпшення живлення рослин та захист урожаю. Велике значення для підвищення врожаю та його збережуваності належить також добривам і засобам захисту рослин.
Генетична інженерія відкриває перед селекцією рослин нові перспективи, які пов'язані з можливістю перенесення в них генів від бактерій, грибів, екзотичних рослин і навіть людини та тварини, що є недосяжним для експериментального мутагенезу та традиційної селекції, в тому числі і генів стійкості. Революційним звершенням у генетичній трансформації рослин стало виявлення природного вектора - агробактерій для перенесення генів та розробка методу мікробомбардування рослинних об'єктів мікрочастинками металів з попередньо нанесеною чужорідною ДНК. Три видатні досягнення фізіології рослин створили основу для інтеграції технології рекомбінантних ДНК в генно-інженерну біотехнологію рослин. По-перше, відкриття фітогормонів, які регулюють ріст і розвиток рослин. По-друге, розробка методів культивування клітин і тканин рослин in vitro (ці методи дали можливість вирощувати клітини, тканини і цілі рослини в стерильних умовах та проводити їхню селекцію на селективних середовищах). По-третє, встановлення феномену тотипотентності соматичних рослинних клітин, який відкрив шлях до регенерації з них цілих рослин.
На сьогодні генетична інженерія сільськогосподарських рослин розвивається переважно в руслі класичної селекції. Основні зусилля вчених зосереджено на захисті рослин від несприятливих (біотичних та абіотичних) факторів, зниженні втрат під час зберігання та поліпшенні якості продукції рослинництва. Зокрема, це підвищення стійкості проти хвороб та шкідників, заморозків або засолення грунтів, видалення небажаних компонентів із рослинних олій, зміна властивостей білка та крохмалю в пшеничному борошні, покращання лежкості та смакових якостей плодів томату тощо. Порівняно з традиційною селекцією, основні інструменти якої - схрещування та відбір, головні переваги генної інженерії - можливість використання принципово нових генів, що визначають агрономічно важливі ознаки та нові молекулярно-генетичні методи моніторингу трансгенів (молекулярні маркери генів), які в багато разів прискорюють процес створення трансгенних рослин. Селекціонерів приваблює можливість цілеспрямованого генетичного "ремонту" сільськогосподарських рослин. Важливим напрямом є створення генетично модифікованих рослин (ГМР) з ознакою чоловічої стерильності. Крім того, завдяки генетичній модифікації, рослини можуть виконувати не властиву їм раніше роль. Це, наприклад, коренеплоди цукрових буряків, що накопичують, замість сахарози, низькомолекулярні фруктози, або банани, які використовують як їстівну вакцину. Завдяки введенню генів бактерій, вищі рослини набувають властивості брати участь у руйнуванні чужорідних органічних сполук (ксенобіотиків), які забруднюють навколишнє середовище. Вирощування ГМР, стійких до широкого спектру хвороб та комах-шкідників, може суттєво понизити, а в подальшому звести до мінімуму пестицидне навантаження на навколишнє середовище. Зростання площ під трансгенними культурами в розвинених країнах відбувається набагато інтенсивніше, ніж у країнах, які розвиваються.
На сьогодні українські селекціонери випробовують трансгенні сорти кукурудзи, цукрових буряків і ріпаку, стійкі до гербіцидів; кукурудзи, стійкої до кукурудзяного метелика; та картоплі, стійкої до колорадського жука. Створено систему органів із залученням генетиків, селекціонерів, генних інженерів, екологів, медиків, токсикологів, які оцінюють трансгенні сорти для визначення потенційного впливу на людину, тварин і навколишнє середовище. І тільки після таких експертиз сорти буде допущено до випробування з дотриманням усіх вимог до трансгенних сортів, узаконених у Європейському Союзі.
Під час розгляду проблеми можливого впливу трансгенних рослин на навколишнє середовище спеціалісти, в основному, обговорюють такі важливі аспекти:
n сконструйовані гени буде передано з пилком близькородинним диким видам, і їхнє гібридне потомство набуде властивості підвищеної насіннєвої продуктивності або здатності конкурувати з іншими рослинами;
n трансгенні сільськогосподарські рослини стануть бур'янами для сільського господарства й витіснять рослини, що ростуть поряд;
n трансгенні рослини стануть прямою загрозою людині, домашнім та диким тваринам (наприклад, через свою токсичність або алергенність).
Ще одним аспектом впливу трансгенних рослин на навколишнє середовище є отримання трансгенних рослин із кращою здатністю використовувати мінеральні сполуки, що, крім посилення росту, буде перешкоджати їхньому змиванню в грунтові води та попаданню в джерела водопостачання.
Гарантією проти небажаних наслідків генетичної модифікації рослин є законодавче регулювання поширення ГМР та розробка пов'язаних із цим методів оцінки екологічного ризику. Багато уваги приділяється посиленню інформованості агрономів, селекціонерів, насіннярів та потенційних покупців про особливості продуктів із генетично модифікованих рослин. В Україні та багатьох інших країнах прийнято закони, які попереджають про покарання за несанкціоноване поширення трансгенного насіннєвого матеріалу, сприяють забезпеченню моніторингу посівів, а також маркуванню харчових товарів, виготовлених із продуктів ГМР або з їхнім додаванням.

О.Л. Кляченко,
кандидат біол. наук, НУБіП України